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摘要：目的基于质量标志物（qualitymarkers，Q-Marker）概念，通过构建当归的药效成分群-生物活性关联网络，确定影响当归药材质量的Q-Marker，建立当归药材的整体质控方法。方法以当归药材表征成分结合主成分分析结果，对15批次不同产地当归药材差异显著的活性成分进行筛选，将初步选定的差异成分作为当归质控的药效成分群。基于关联规则，建立体外、体内活性成分筛选评价模型，通过挖掘组分间关系，以此确定当归药材的Q-Marker，并建立了Q-Marker同时定量的测定方法。结果经UPLC-TOF/MS技术及药动学参数预测，找到当归中11个具有潜在药效活性的药效成分群。经药效成分群-生物活性关联网络分析，将阿魏酸、Z-藁本内酯和欧当归内酯A作为当归质控的Q-Marker，其方法学结果显示，3种化合物线性关系良好，r＞0.，精密度、重复性和稳定性良好，平均加样回收率范围为99.18%～.25%。结论基于药效成分群-生物活性关联概念，采用多元统计结合液质联用分析技术的当归药材Q-Marker辨析方法，可以初步明确与当归药效紧密联系的化学成分来源，为当归的整体质量控制提供相关数据。

中药材是生产中药饮片和中成药的基本原料，其质量是保证中药饮片和中成药质量的关键和基础。因此，中药材质量的规范化是保证中药材质量的重要措施和重要前提。国务院于年发布了《关于促进医药产业健康发展的指导意见》，明确提出完善中药质量标准体系，提高中药质量标准的科学性和合理性。同年，刘昌孝院士[1]率先提出中药质量标志物（Q-Marker）的核心概念和理论，为提升我国中药产品质量和质量控制水平研究指明了方向[2-3]。基于中药整体质量控制的研究要求，本课题组认为，中药的整体质量不是单一成分药效的简单加合，而是存在着成分间多层次、多环节、多维度的非线性/线性协同作用。因此，要建立中药整体质量评价体系，首先要对影响中药质量的药效成分群-生物活性的互作因素及其功效相关的生物效应进行关联性分析，挖掘其内在的规律，对于找到关系药材整体质量的Q-Marker有重要涵义。这也是对于中药材、中成药整体质量提升与开发研究关键科学问题的初步认知。

当归为伞形科二年生草本植物当归Angelicasinensis(Oliv.)Diels的干燥根，其药用记载始见于《神农本草经》，距今已有多年历史。当归具有浓郁的香气，味甘、辛、微苦，具有补血活血、调经止痛、润肠通便的功效。临床主要用于治疗血虚萎黄、眩晕心悸、虚寒腹痛、风湿痹痛、跌扑损伤、肠燥便秘等症[4]。作为典型的生境主导型道地药材，产地生态环境是影响当归品质的主要因素，其道地主产区为甘肃南部，如岷县、宕昌等地区。其他产地如云南、四川、湖北等地也有少量分布。由于受到当归价格上涨等因素的影响，当归的种植规模在非传统产区有迅速扩张趋势。然而，由于药材生态环境的适宜性差异导致了各产区当归药材的质量参差不齐，也给当归质量控制带来很大困难[5-6]。目前对当归质量的控制主要参考《中国药典》年版，其中仅以阿魏酸作为单指标成分来评价当归质量，而川芎、藁本的指标性控制成分也是阿魏酸，因此单一成分并不能科学、全面、准确反映药材的内在质量[7-8]。针对目前当归质量参差不齐导致临床疗效不稳定的问题，本研究采用高分辨液质联用技术结合中药成分数据库对当归提取物的化学成分进行表征，以药动学参数（absorption-distribution-metabolism-excretion/toxicity，ADME/T）建议筛选标准对匹配化合物进行药效成分群筛选；选择当归的主要体外抗氧化指标和体内抗血虚、抗血瘀功效指标，通过建立体外和体内生物活性和主要成分的关联，找到与当归生物活性相关系数较高的成分，并将这些成分作为当归质控的Q-Marker。最后建立当归Q-Marker含量测定方法学，以此完成以成分映射药效的当归质量标志物的研究方法。

1仪器与材料

1.1仪器

AcquityH-CLASS型超高效液相色谱（UPLC，美国沃特世科技有限公司）串联TripleTOFTM+质谱仪（美国爱博才思公司），液相配置：二元超高压溶剂系统、FTN自动进样管理器、PDA检测器和Empower3色谱工作站；AgilentInfinityII型超高效液相色谱（UHPLC，美国Agilent公司）串联ABSciexQtrap三重四级杆线性离子阱质谱仪（美国ABSciex公司），液相配置：GA四元梯度泵、GB自动进样器、GA柱温箱；SartoriusCPAD型十万分之一电子分析天平，德国赛多利斯科学仪器有限公司；KQ-DE型数控超声波清洗器，江苏昆山市超声仪器有限公司；DZKW-S-4型电热恒温水浴锅，上海科恒实业发展有限公司；GeneVacmiVac低温离心浓缩仪，英国GeneVac公司；Thermo型全波长酶标仪、ThermoMicro17R微量低温冷冻离心机，美国赛默飞世尔科技有限公司；FT-动物跑步机，成都泰盟软件有限公司。

1.2试剂

对照品阿魏酸，批号-14，质量分数99.0%，中国食品药品检定研究院；对照品Z-蒿本内酯，批号wkq，质量分数≥98%，四川省维克奇生物科技有限公司；对照品欧当归内酯A，批号MUST-，质量分数99.90%（HPLC），成都曼思特生物科技有限公司；GSH-PX试剂盒、羟自由基试剂盒，南京建成生物工程研究所；DPPH试剂，批号W27F10E，上海源叶生物科技有限公司；总抗氧化能力检测试剂盒（ABTS快速法），上海碧云天生物技术有限公司；肝素钠一次性使用真空采血管，江苏宇力医疗器械有限公司；盐酸肾上腺素注射液，远大医药（中国）有限公司，批号；甲酸（FlukaTM），色谱纯，美国霍尼韦尔公司；乙腈，色谱纯，德国默克公司；其他试剂均为分析纯。实验用水为屈臣氏蒸馏水。

1.3药材

本研究所用各批次当归药材购于甘肃省，经陕西中医药大学刘世军教授鉴定为伞形科植物当归A.sinensis(Oliv.)Diels的干燥根。当归对照药材，批号-613，购于中国药品生物制品检定研究院。15批当归药材及对照药材信息见表1。

1.4动物

SPF级SD雄性大鼠，6～8周龄，体质量为（±20）g，由成都达硕实验动物有限公司提供，许可证号：SCXK（川）-。环境温度（23±2）℃，湿度（50±10）%，12h光/暗循环（光照时间8:00～20:00），自由进食饮水。在实验开始前每天给予连续5min的抚摸适应，1周后大鼠随机分组，每组6只。所有动物实验遵循陕西中医药大学实验动物伦理委员会有关实验动物管理和使用的规定，均符合3R原则。

2方法与结果

2.1UPLC/Q-TOF-MS/MS成分表征及指纹图谱测定

2.1.1色谱条件优化流动相分别比较了乙腈-水和甲醇-水2个溶剂系统，结果表明，用乙腈-水二元梯度洗脱系统比用甲醇-水梯度洗脱基线平，且耗时短。分析时间仅用30min，样品1h谱图显示，30min后无特征峰出现。

以相邻2峰的分辨率之和（∑Rs）、色谱分离系数（r*）、色谱信息量（Ф）和分层色谱响应值（hierarchicalchromatographicresponsefunction，HCRF）对指纹图谱的分离峰个数（N）、分离度和分析时间性能进行评价，色谱分离质量评价计算公式见式1～3[9]。

Ri,i+1为相邻两峰之间的分辨率，n为峰的总个数，为n个峰的相邻两峰分辨率的平均值

Ai为色谱峰面积，Ri为相邻两峰间分离度，ni为理论塔板数

HCRF＝0n＋00Rmin＋tmax－tmin（3）

Rmin为最小分离度，tmax－tmin为最大与最小保留时间之差

为了获得最佳的参数设置，选择柱温（25～35℃）、体积流量（0.2～0.5mL/min）、缓冲液浓度（0.1%～0.2%甲酸水溶液、0.05%～0.2%乙酸水溶液）、水相初始比例（95%～99%），色谱柱类型［柱1（50mm×2.1mm，1.7μm）；柱2（mm×2.1mm，1.7μm）；柱3（mm×2.1mm，2.5μm）］作为优化参数，结果见表2。优化结果显示，缓冲系统为0.1%甲酸水溶液，柱温为30℃时，水相初始比例为98%，体积流量为0.3mL/min时，各峰分离度均＞1.5，理论塔板数参数优化结果较好，以各色谱峰计算均＞，因此将此作为固定条件进行样品测定。

2.1.2测定波长选择检测波长经过对光电二级阵列管检测器检测三维图谱分析，根据当归药材中主要成分的特征波长，从波长～nm选取代表各单味药材的重点波长nm，进行指纹图谱评价。

2.1.3测定条件

（1）质谱条件：离子源为电喷雾离子源（ESI），正离子模式下，采用信息依赖采集（IDA）、动态背景扣除（DBS）和高灵敏度模式采集数据。母离子（TOF-MS）扫描范围m/z50～1，对超过cps的8个最强峰进行MS2采集数据，子离子（MS/MS）扫描范围为m/z50～1。源喷射电压（ionsprayvoltagefloating）为V，裂解电压（declusteringpotential，DP）为40V，碰撞能量（collisionenergy，CE）为10eV，雾化气（ionsourcegas1，GS1）和辅助气（ionsourcegas2，GS2）为氮气，皆为.kPa（50psi），气帘气（curtaingas，CUR）.kPa（35psi），雾化温度（temperature，TEM）℃。

（2）色谱条件：采用AcquityUPLC?BEHC18（50mm×2.1mm，1.7μm）色谱柱；流动相为0.1%甲酸水溶液-乙腈，梯度洗脱程序为0～1min，2%乙腈；1～18min，2%～%乙腈；18～20min，%乙腈；20～23min，%～2%乙腈；23～25min，2%乙腈；体积流量为0.3mL/min；进样量2μL；柱温30℃。

2.1.4供试品溶液的制备参照《中国药典》年版一部当归含量测定项下供试品溶液的制备方法，称取当归粉末（过三号筛）约0.2g，精密称定，置于锥形瓶中，精密加入20mL70%甲醇，称定质量，85℃水浴回流30min，静置放冷，称定质量，加入溶剂补足减少的质量，摇晃均匀后静置，取上清液滤过，精密量取续滤液1mL，至10mL量瓶中，用70%甲醇稀释至刻度，摇匀，取续滤液，即为供试品溶液，备用。

2.1.5对照品溶液的制备参照《中国药典》年版一部当归含量测定项下对照品溶液的制备方法，取阿魏酸对照品适量，精密称定，置棕色量瓶中，加70%甲醇制成含阿魏酸12μg/mL的对照品溶液，即得。

2.1.6谱峰筛选将UPLC/Q-TOF-MS/MS分析检测得到的图谱数据导入PeakView2.2软件对化合物进行鉴定（图1-A）。通过对各样品正离子模式下UPLC/Q-TOF-MS/MS总离子流图比较、分析及筛选得到18个共有特征峰，其峰面积之和占总峰面积的90%以上（图1-B）。具有一定的代表性。根据PeakView2.2软件、Masterview的中药成分数据库并结合一级质谱准分子离子峰、二级质谱碎片信息以及文献对18个化合物进行鉴定。根据PeakView2.2软件分析其元素组成，并结合一级、二级质谱碎片信息以及文献，对当归指纹图谱中的共有峰进行鉴定，大致推断出18个化合物的可能结构信息（表3）。

2.2药效成分群筛选

本标准采用ABSciexmasterview中药成分数据库（TCMLibrary1.0）作为从指纹图谱共有峰中筛选药效成分群的匹配库，参考TCMSP数据库参数及SwissADME（